微生物计数和生物量测定方法

2025年9月1日 2 分钟阅读

在微生物发酵行业，生物量是指微生物细胞的总量。生物量检测是微生物发酵行业最基本的，也是最重要的技术手段之一。生物量也是发酵过程控制中的重要控制参数和目的参数。而除常规的生物量检测外，我们也会碰到一些特殊情况下的生物量检测。比如：霉菌的生物量检测，复杂基质中的微生物检测，混合菌群下分别计数，特定微生物检测等。

于2025年8月更新。

一、直接法

直接法：衡量生物量大小的直接方法可以是细胞个体的多少，也可以是所有细胞的重量，这些方法是直接法。包括显微计数，平板计数，干重，湿重等。

▶显微计数

光学显微镜分类、结构和基本原理(明场，暗场，相差)

利用显微镜直接计数，我们常用的是血球板计数，血球板计数的实质是数微小体积的细胞数量，然后换算1mL的细胞数量。因此血球板计数的计算公式是：

酵母细胞个数／1mL＝小方格细胞总数 ×400×10000×稀释倍数

其中：

小方格细胞总数：小方格为血球计数板中最小的方格，体积为是1/400 mm3

400：一个大方格含有小方格的数量。小方格的细胞总数，通过计算4个或者5个中方格中细胞总数，然后除中方格含有的小方格数来获得。因此上述公式可变为：

16×25 型的计数板：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数

25×16 型的计数板：酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数

小方格细胞总数 ×400：可计算出中方格的总菌数量，而大方格的体积为0.1mm3

10000：是mm3 和 mL（cm3）之间的换算。

详细情况可查阅以下文件

通过网盘分享的文件：血球计数板的使用及问题讨论.pdf等2个文件

链接: https://pan.baidu.com/s/1xtK0U83QoyTTaNA4cq8IHg?pwd=wswf 提取码: wswf

▶平板计数

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

具体方法可参考以下标准方法:

通过网盘分享的文件：GB4789.2-2022-菌落总数.pdf等2个文件

链接: https://pan.baidu.com/s/1WqcBLwEWTUkdwIMdEn1EJg?pwd=wswf 提取码: wswf

▶干重和湿重

湿重是发酵行业最为便捷的一个指标，能够快速的掌握生长状态，特别是在高密度培养中。其测定和计算比较简单。

干重是发酵工业中最为权威的方法，特别是在动力学指标测定中，干重是常用指标。该方法是将单位体积培养液中的菌体用清水洗净，然后放人干燥器内加热或减压干燥，最后再用精密仪器测定其干重。一般说来，干重为湿重的20%—25% ，即1mg干菌=4—5mg ，湿菌=（4—5）*109个菌体。（不同菌体可根据需要调整，建立自己的计算公式，甚至可以和OD值进行换算。）

二、间接法

▶比浊法

顾名思义，比浊法就是测定微生物导致的浊度变化来间接衡量微生物生物量的大小。也是最为常用的方法之一。其中测定OD值是最为常用的方法。

什么是OD值：

OD值是吸光度或者光密度，在微生物领域是用来衡量菌体密度，或者菌体生物量的非常重要的参数。

《科技编辑大辞典》对光密度的定义是：入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值。专业书籍则这样解释“吸光度”：入射光和透射光的透过率之比值的常用对数值，也称光密度。分析可见，两个概念其实是一致的，“光密度”就是“吸光度”，且用“光密度”符合国家标准，更规范。

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。OD值通过量化“被吸收光的比例”来反映物质的浓度、纯度或特性。

OD值的测定

OD值的测定大概分为以下步骤。

1.确定波长，可以做全波长扫描，然后看看那个波长吸光度比较大，便于检测。不过对于微生物菌体一般用OD600。

2.稀释，由于设备的问题，吸光度值只在某个范围内比较准确，因此必须对样品进行稀释，读数范围0.1-1之间。

3.测定样品，做2-3个重复。

▶代谢物法

代谢法在这里是指通过微生物代谢活动间接衡量生物量的方法。不同数量的微生物，其底物的消耗，产物的生成，遗传因子的数量等都是不同的。比如通过测量DNA含量，总氮，总碳，基于微生物生长动力学的生物量模型，还有当前比较热门的的微生物组学的方法，也是通过对RNA，特定基因（Cpn60蛋白，rpoB一般为一些保守的基因）的含量进行计数的。该方法一般用于比较特殊的情况，比如土壤微生物总量的衡量。