微生物染色技术

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1.染色液配制

1）结晶紫液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL，将两液混匀置24h后过滤即成。
2）番红溶液：番红O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

2.应用：简单染色法操作简便，适用于菌体的一般形态和排列的观察。

3、实验步骤
1）涂片。在洁净的载玻片上滴加一滴无菌水，然后用无菌接种环挑取适量细菌悬浮液并涂成薄膜。或吸取一定量的液体培养物滴在载玻片上，可多次尝试，使得视野中的菌满足目的要求。
2）固定。固定前需要有样品干燥的过程，可以自热干燥，也可以借用酒精灯的温度，需要掌握温度不能太高。固定时：在酒精灯上方加热，但要注意温度不要过高，以免破坏细菌的形态，手指轻叩微烫即可（干燥的样品过火焰5-8次）。也可以使用化学固定剂（如甲醛）来固定细菌，以确保细菌的形态不受损失。
3）染色。滴加染液覆盖涂片，让细菌与染液充分接触，通常染色时间为1-3min。
4）冲洗。用洗瓶冲洗涂片，直到流出的水中无染液颜色为止。
5）干燥。将涂片自然晾干或用吸水纸轻轻吸干，可在酒精灯上干燥，需要掌握温度。
6）镜检。使用显微镜观察细菌的形态和结构。

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1、原理：

(1)G+ 菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色；G– 菌细胞壁结

构疏松(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。

(2)G+ 菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇

脱色。G– 菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。

(3)G+ 菌等电点比G– 菌低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。

2、应用

革兰染色法的实际应用意义有三：

(1)按照革兰染色法可把细菌分为G+ 和G– 两大类；

(2)G+ 菌和G– 菌的致病性不同，所致疾病各异；

(3)对G+ 和G– 菌，选择不同抗菌物治疗。

3、材料

(1)葡萄球菌和大肠埃希菌培养18～24h 后的混合菌液。

(2)兰染色液：结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄染液。

(3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等。

4、方法

4.1标本片制备 

(1)载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约1～2cm 

的涂抹范围，用数字或符号做好标记。

(2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种

环在火焰上烧灼灭菌。(3)干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精灯火焰约半尺高处缓慢烘干，切不可放在火焰上烧干。

(4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住，使涂抹面向上缓慢通过火焰3 次，然后自然冷却。

固定即可杀死细菌，并使细菌固着于玻片上，以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固，而易着色。

4.2革兰染色： 

(1)初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液1～2 滴，作用1min 后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。

(2)媒染：滴加卢戈(Lugol)碘液数滴，作用1min 后水洗。碘液是媒染剂，使结晶紫染液与

细菌结合更牢固。

(3)脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻晃动玻片，使玻片上流下的酒精液无紫色为止(约需0.5～

1min)，流水冲洗。

(4)复染：滴加稀释复红(或沙黄)染液数滴，作用1min 后流水冲洗。最后用吸水纸印干标本

片或自然干燥后，玻片上滴加香柏油，用油镜观察。

5、结果

G+ 菌染成紫色；G– 菌染成红色。

6、影响因素

⑴操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过份

受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。

⑵细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老

龄菌被染成红色。细菌染色时最好用18～24h 的细菌培养物。

⑶染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后

易失去媒染作用。脱色酒精以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使酒精浓度下降而减弱其脱色能力。

革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌区别及染色原理

【微生物学】KOH快速鉴定革兰氏阴性和阳性菌法

1、原理与应用

细菌鞭毛为细菌的运动器官。其形态细长，直径约10～20nm，需用电子显微镜才能观察到。

若用特殊染色使鞭毛增粗并着色，则在普通光学显微镜下也可观察到。鞭毛染色方法很多，但原理基本类似，即在染色前先经媒染剂处理，使鞭毛增粗，然后再进行染色。

2、材料

(1)变形杆菌6～8h 血琼脂平板培养物。

(2)染色液。

A 液：200g/L 钾明矾液(加温溶解)20ml，50g/L 石炭酸液50ml，200g/L 鞣酸液(加温溶

解)20ml。

B 液：复红酒精饱和液。

取A 液9 份和B 液1 份混合后立即过滤。滤液放置6h 后，使用最佳。

（3）蒸馏水管

3、方法

(1)细菌标本制备：取变形杆菌血琼脂平板培养物，仔细从菌膜伸展最远处挑取菌少许，轻轻放入蒸馏水管中，经数min 使其自行分散，再37 25 ℃ ～30min。

(2)涂片：取上述菌液一接种环，轻轻滴于载玻片上，使成薄膜。涂抹时接种环随水滴移动，

切勿与玻片相磨，以免鞭毛脱落。 (3)染色：涂片自然干燥(勿用火焰固定)后，加染色液作用1～2min ，水洗、吸干、镜检。

4、结果

鞭毛呈淡红色，菌体呈红色。