多维度优化策略提高L-苏氨酸在大肠杆菌中的表达

2024年11月26日 1 分钟阅读

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随着合成生物学和基因编辑技术的飞速发展，通过系统代谢工程对微生物进行重编程以高效生产目标化学物质已取得重大成果。文章从多个角度出发，解除L-苏氨酸的合成途径，提高表达水平。

通过解除L-苏氨酸合成的途径的瓶颈提高表达水平

如下图所示，葡萄糖经过糖酵解途径，TCA循环，最终通过草酰乙酸盐进入氨基酸的合成途径。在整个合成过程中需要各种关键酶，辅助因子NADPH，以及供能（ATP）的参与。因此，通过过表达或者更换更加高效的关键酶的基因（adhpa，asdTm），敲除消耗ATP的pckA基因，转入外源的能够产生1个ATP的PCKA基因（从丙酮酸转化为OAA），能够有效提高L-苏氨酸在大肠杆菌中的表达水平。

OAA：草酰乙酸（Oxaloacetic acid, OAA, 或称草乙酸，oxalacetic acid）是一种结晶有机化合物，化学式：HO2CC(O)CH2CO2H。其共轭碱为生物体内许多代谢常见的中间物。参与糖质新生、尿素循环、乙醛酸循环、氨基酸合成、脂肪酸合成以及柠檬酸循环等作用。

碳代谢通路的优化

OAA是L-苏氨酸的前体物质，由下图可以看出OAA可以有两个来源，途径一是从丙酮酸直接转而来，途径二是，丙酮酸经过TCA循环最终转化为OAA。途径二，丙酮酸经过TCA循环，能够为细胞的生长提供更多的能量和物质，能促进细胞的生长，但是降低了OAA的合成。GLT基因是乙酰辅酶A进入TCA循环的关键酶。采取了两种策略对该酶进行优化：①将该酶的启动子更换为动态调控的启动子（Pflic promoter），②更换为其他来源的基因。结果表明，GltA F383M能够提高L-苏氨酸的表达。

静态调控：静态调控是指通过设计和改造遗传编码组件对目标代谢通路进行静态优化的代谢工程改造策略。这种改造方式的最大特征是定向、不可逆性，改造后的细胞在生长过程中不具备感应指定信号而做出特定调整的能力。

动态调控：动态调控是通过设计与构建基因通路单元，使重组细胞可以动态地感应并处理特定信号，从而根据信号的改变进行适应性调控，达到产物合
成或目标系统的最优化状态。该系统中的特定信号可以是代谢通路中的中间产物、细胞系统的代谢物或蛋白等因子，也可以是外源引入合成的信号分子等。相比于静态调控，动态调控是一个以信号响应为基础的动态调控过程，因此可以在线感知细胞状态并进行实时代谢调控。

转录组分析和理性优化

对工程菌的代谢工程改造是提高目的产物产量的有效方法，但是关键代谢途径的筛选是非常关键的。通过转录组分析能够有效的降低该过程的工作量。通过筛选上调和下调基因，最终筛选出UspA蛋白能够有效提高L-苏氨酸的表达。USPA蛋白可能和细胞的抗逆性（饥饿，渗透压，高温，DNA损坏修复）有关系。

提高菌体对逆环境的抗性

菌体的鲁棒性是衡量菌体表现的重要指标。在大肠杆菌表达L-苏氨酸的过程中，由于外源氨基酸的积累可能会导致渗透压的增加，此外还会受到溶氧水平的限制。irrE是一个全局的转录调控因子，结果证明irr能够进一步提高重组菌的表达水平。由vgb表达的血红素蛋白能够提高细胞和氧气的结合，从而提高能量的供应，研究结果表明，vgb能够有效提高L-苏氨酸的表达水平，但是在发酵罐中并未表现出效果，这可能是因为发酵罐的供氧能力较好。

鲁棒性（robustness）：鲁棒性是音译词，在微生物发酵行业，鲁棒性是指菌体抵抗外部干扰的能力。

解触葡萄糖抑制提高L-苏氨酸的表达水平

Ptrc作为目的基因的启动子，受到CRP-cAMP复合体的激活，但是细胞内的cAMP水平会受到高葡萄糖浓度的抑制。这就阻碍的了在发酵初期目的产物的合成。通过过表达crp转录调控因子，能够解除cAMP对Ptrc 的作用，从而解除葡萄糖的抑制作用，能够有效提高L-苏氨酸的表达。

参考文献：Engineering Escherichia coli for L‑Threonine Hyperproduction Based on Multidimensional Optimization Strategies