01
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| 成像原理 | 可见光
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电子束
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根本区别
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| 分辨率 | 约 200 nm
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< 1 nm
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核心优势
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| 放大倍数 | 最高约 1000-1500倍
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最高可达 1,000,000倍 或更高 |
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| 景深 | 较浅 | 非常浅
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| 光源 | 卤素灯或 LED
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电子枪
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| 透镜 | 玻璃透镜
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电磁透镜
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| 观察介质 | 空气、水或油
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高真空
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关键操作环境
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| 样品要求 | 相对宽松
– 可观察活细胞、组织切片。 – 通常较厚（微米级）。 – 染色（增强对比度）或天然状态（如相差显微镜）。 |
非常严格
– 必须干燥 (真空要求)。 – 非常薄 (TEM 需 50-100 nm 超薄切片)。 – 导电处理 (SEM：喷金/铂等，防止电荷积累)。 – 固定、脱水、包埋 (常用)。 |
主要限制
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| 图像类型 | 彩色图像
或 灰度图像 (如相差、微分干涉)。 |
灰度图像
– TEM：内部结构投影（类似X光片）。 – SEM：表面形貌三维感图像。 |
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| 操作环境 | 常压、室温 | 高真空
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| 操作复杂性 | 相对简单易用 | 非常复杂
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| 设备成本 | 相对较低
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非常昂贵
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| 维护成本 | 较低 | 非常高
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| 主要类型 |
– 暗场 – 相差 – 微分干涉相差 (DIC) – 荧光 – 共聚焦激光扫描 (CLSM, 分辨率略优于普通LM) |
– 扫描电镜 (SEM)：观察样品表面形貌。 – 扫描透射电镜 (STEM)：兼具部分TEM和SEM功能。 |
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| 主要应用领域 |
– 组织学/病理学 – 微生物学 – 材料科学 (宏观结构、缺陷) – 教育 |
– SEM：材料断口、表面形貌、纳米结构、花粉、昆虫、细胞表面。 |
互补性
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02
▼Bright-field Microscope
明场显微镜是一种光学显微镜，它使用光线在明亮的背景下产生暗图像。它是生物学、细胞生物学和微生物实验室研究中使用的标准显微镜。样品放在玻璃载玻片上，采用光源（通常是卤素灯或发光二极管（LED）灯）照射。光线穿过样品，物镜将图像放大并投射到目镜或相机上。在明亮的背景下，样品呈现暗色，因此称为“明场”。
光线会被载玻片上的样品吸收或则分散，导致亮度的对比，从而能够观察到样品。
现代显微镜的光源为电子光源，光源通过聚光系统聚集在样品上，然后依次通过物镜和目镜放大。物镜一般在10-100倍，目镜在10-30倍。而终放大倍数是两者的乘积，最大放大倍数可达到1000倍以上。0.2μm是光学显微镜的极限，继续增加放大倍数，效果并不理想。这主要受限于光源的波长和物镜系统收光的效率。
数值孔径(Numerical Aperture，简称NA)是光学系统中的一个重要参数，用于描述该系统能够收集光的角度范围。
光学显微镜中，样品之所以能被看见，是因为目标物体和周围环境的光强度不同，对比越强烈，观察效果越清晰。但是对于一些细菌，由于其和周边的液体环境差异较小，难以产生较大差异，因此难以观察清晰。这就需要用到染色技术。
微生物染色技术，虽然能够增强对比度，但是会破坏微生物，因此不能观察到微生物的真实状态。相差显微镜（Phase-contrast）和暗视野显微镜（dark-field).
▼Phase-contrast Microscope
| 设备成本 |
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| 样本限制 |
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| 耗材要求 |
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| 光学限制 |
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相差是一种光学显微镜技术，用于增加未染色样本的对比度。未染色样本的结构，例如活细胞或其细胞器，在明场照明下观察时可能显得模糊，甚至变得透明。若使用相差显微镜观察相同的样本和结构，就能以更高的对比度和更丰富的细节，清楚呈现这些样本和结构。
原理：当光线穿过细胞时，会发生微小的相位偏移，这些变化是人眼看不见的。在相差显微镜中，这些相位偏移被转换为振幅的变化，这可以观察到图像对比度的不同。
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相位物体特性：透明样本不吸收光，但因折射率或厚度差异使衍射光相位延迟约 1/4 波长，而直射光相位不变。
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人眼感知局限：无法直接识别相位差，仅能感知光强（振幅）和颜色变化。
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干涉增强对比度：通过相位板使直射光与衍射光相位差达 1/2 波长，发生相消干涉（暗反差）或相长干涉（明反差），将相位差转化为光强差异。
应用场景：
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生物医学领域
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观察活细胞、未染色组织、微生物等透明样本，避免染色对样本活性的影响，适用于细胞动态监测（如细胞分裂、鞭毛运动）。 -
可与荧光显微镜结合，同时观察荧光标记区域与非荧光结构。
工业与材料科学
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分析透明或半透明材料（如薄膜、胶体）的厚度和折射率差异，检测内部结构均匀性。
局限性：
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光学伪影
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样本边缘易出现光晕（Halos），可能掩盖细节，影响图像清晰度。
分辨率限制
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环形光阑限制光学系统数值孔径（NA），导致分辨率略低于明场显微镜，难以观察细微结构。
样本适用性
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不适用于厚样本（焦平面外相位差干扰成像），更适合薄样本或单细胞层。
颜色限制
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白光下图像呈灰色，绿光滤光片下呈绿色，早期需黑白胶片拍摄，现可通过彩色数字成像改善。
▼Dark-field Microscope
由左到右分别为：明场显微镜，相差显微镜和暗视野显微镜下的酿酒酵母。
暗场显微镜是一种光学显微镜，通过特殊聚光器使光线以倾斜角度照射样本，仅样本散射或反射的光线进入物镜，形成明亮样本与黑暗背景的高对比度图像。
原理：
阻挡直射光：暗场聚光器内置中央圆形光阑（或遮光板），阻挡中央直射光，仅允许光线从聚光器边缘以 ** 倾斜角度（大孔径）** 照射样本。
散射光成像：光线照射样本时，颗粒或结构边缘产生散射光，仅散射光进入物镜，背景因无直射光而黑暗，样本因散射光而明亮。
应用：
生物学与医学：
活体微生物观察：如 ** 梅毒螺旋体（Treponema pallidum）** 的快速检测（临床样本中无需染色）。
细菌与原生动物运动性分析：观察鞭毛细菌的运动（如大肠杆菌）。未染色样本：组织培养物、单细胞生物（如藻类、原生动物）。
材料科学与工业：
表面结构研究：纤维、毛发、矿物、晶体、聚合物薄膜的边缘或表面缺陷。
微小颗粒检测：如陶瓷中的杂质、水中的浮游生物（如硅藻、浮游动物）。
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
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2. 高对比度：适合透明或微小样本 3. 操作简单：可通过改装普通显微镜实现 4. 低伪影：成像过程减少人工假象 |
2. 内部结构难辨：主要观察表面或轮廓，不适用于厚样本内部 3. 分辨率限制：依赖散射光，细节分辨率低于明场显微镜 |
▼Differential interference contrast Microscope 微分干涉对比（DIC）显微镜
Differential Interference Contrast（DIC）显微镜技术通过偏振光经棱镜分裂为正交光束，利用样本厚度和折射率差异产生光程差及相位差，经干涉后转化为强度对比，形成伪 3D 效果图像，适用于观察未染色厚样本（如脑切片），尤其适合电生理实验。其 setup 需安装偏振器、物镜专用棱镜、检偏器等组件，需进行Koehler 照明校准和偏振器与检偏器 90 度正交对齐，使用 IR 光源可增强组织穿透性，且需注意避免灰尘影响成像质量。
酵母细胞的DIC图
- 偏振光分光：起偏器将自然光转为线偏振光，经聚光镜棱镜（如 DIC II/III）分裂为正交偏振的两束平行光，间距小于显微镜分辨率。
- 样本交互：两束光因样本厚度或折射率差异产生光程差，导致相位差（1/200 至 1 个波长，相机可检测 1/1000 波长）。
- 干涉与成像：物镜棱镜重组光束，检偏器将椭圆偏振光转为平面偏振光，相位差转化为振幅差异（明暗对比），形成 3D 浮雕效果。
-
Polariser（起偏器）：产生偏振光，使入射光成为具有特定振动方向的偏振光，为后续利用偏振特性成像做准备，常见于偏光、DIC（微分干涉相差）等显微镜技术 。 -
Condenser with quarter waveplate（带四分之一波片的聚光镜）：聚光镜汇聚光线照亮标本，四分之一波片可将线偏振光转换为圆偏振光（或反之），在 DIC 等技术中用于调节光的偏振状态，优化成像对比度 。 -
Objective specific prism（物镜专用棱镜）：与物镜配合，在 DIC 等工作模式下，对光线进行分光、合光等操作，利用标本不同部位的光程差等差异，将相位差转化为振幅差，实现透明标本的清晰成像 。 -
Nosepiece with prism（带棱镜的物镜转换器）：可切换不同物镜，其上棱镜参与光路调控，保障不同物镜切换后，偏振、DIC 等成像模式的光路稳定 。 -
Objective（物镜）：放大标本，是决定显微镜分辨率和放大倍数的关键部件，不同物镜适配不同观察需求（如高倍、低倍，常规观察或特殊偏振观察 ）。 -
Analyser（检偏器）：与起偏器配合，检测经过标本后的偏振光状态变化，通过偏振光的干涉等作用，将标本的结构差异转化为可见的明暗、色彩对比，呈现标本细节 。
优点：
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无需染色即可观察 -
活细胞和生物体，避免染色毒性； -
成像具有立体感（浮雕状），无晕轮伪影； -
支持较厚标本的光学切片成像。
| 设备成本 |
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| 样本限制 |
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| 耗材要求 |
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| 光学限制 |
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▼Fuorescence Microscope 荧光显微镜
一、定义：
荧光显微镜，是一种借助荧光或磷光现象实现样本观察的光学显微镜。它的核心奥秘在于，通过激发样本中的荧光分子（荧光染料或自发荧光物质），让这些分子发射出特定波长的光，从而在黑暗背景下形成明亮的图像。与传统明场显微镜相比，荧光显微镜就像是微观世界里的 “聚光灯”，能精准照亮我们想要观察的目标，带来更高的对比度和清晰度。
二、原理
荧光显微镜的工作原理，就像一场精密的 “光影魔术”，主要分为以下几个关键步骤：
荧光激发与发射：光源（如汞灯、LED 或激光）发出的短波长光（激发光），经过激发滤光片的筛选，成为特定波长的光束，照射到样本上的荧光分子。这些荧光分子吸收激发光的能量后，会跃迁到高能态，随后以 ** 长波长光（发射光）** 的形式释放能量，产生绚丽的荧光信号。光路分离：在荧光显微镜中，** 二向色镜（分光镜）** 扮演着 “光的指挥官” 的角色。它能够反射短波长的激发光，使其聚焦到样本上，同时允许长波长的发射光顺利通过，进入检测器。最后，发射滤光片会进一步过滤掉杂散光，只让特定波长的荧光通过，这样，我们就能在目镜或相机中看到清晰、高对比度的荧光图像了。
三、应用场景
荧光显微镜凭借其独特的优势，在众多领域都发挥着不可或缺的作用：
- 生物医学研究：它是生命科学领域的 “火眼金睛”。科学家们可以用它标记细胞膜、细胞器和细胞骨架，观察细胞的内部结构；也可以追踪蛋白质定位、基因表达，深入研究分子机制；还能通过荧光抗体染色，快速检测病原体。例如，在研究癌症细胞的分裂过程时，荧光显微镜能清晰呈现癌细胞内各种分子的动态变化，为癌症治疗提供关键线索。
- 材料科学：在材料科学的微观世界里，荧光显微镜同样大显身手。它可以用于纳米材料的表征，帮助科学家了解纳米颗粒的分布与相互作用；也能对聚合物与涂层进行分析，检测材料中的荧光添加剂或缺陷。
- 食品与环境检测：在食品行业，荧光显微镜可以分析食品成分的荧光特性，检测食品质量；在环境领域，它能快速检测水体或土壤中的荧光标记微生物，助力环境监测与保护。
- 工业与半导体：在工业生产和半导体制造中，荧光显微镜可用于半导体缺陷检测，标记芯片表面的杂质或损伤位点；还能对纺织品与陶瓷进行分析，评估纤维结构和陶瓷孔隙率。
四、优点
高灵敏度与特异性：荧光显微镜就像微观世界的 “超级侦探”，能够检测低至单分子水平的荧光信号。结合抗体或基因编辑技术，它可以精准靶向特定的分子或细胞结构，实现高特异性成像。
尽管荧光显微镜优势显著，但也存在一些局限性：
样本制备限制：使用荧光显微镜需要对样本进行标记，无论是荧光染料还是荧光蛋白，都可能会干扰样本的天然状态，影响实验结果。此外，一些样本本身存在自发荧光，这也会对观察造成背景干扰。
参考文献：微生物书籍 Brock Biology of Microorganisms
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