高通量筛选方法的建立及应用

微生物菌种的改造是现代微生物发酵行业中，提高其工业化生产性能，提高酶和菌的性能非常重要的一个环节。而快速高效的高通量筛选方法的建立又是菌株改造中非常重要的一个环节。以下介绍的仅仅是高通量快速筛选方法中一个环节的内容，如果想建立快速筛选方法，还需要有其他方面的工作要做。

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高通量筛选方法的信号检测策略

何为高通量快速筛选方法？就是通过将需要筛选的表型（高酶活，某种物质的高产量）和一种能够方便被人眼或者仪器快速识别并判断高低的物质或者信号想关联，而建立起来的筛选方法。

常用的信号有荧光检测，拉曼光谱检测，风光光度计，颜色圈，透明圈，菌落大小，抑菌圈等。

 

 

合适的信号检测策略是筛选方法建立的核心问题，目前突变库筛选中常用的检测主要基于荧光信号。近年来吸光度和拉曼光谱等开始应用于液滴微流控筛选体系中。
将可检测信号和目的产物表达水平建立关系可分为多种方法，需要根据目标产物进行设计优化。例如如对于酶制剂的筛选，可通过酶活性大小来进行筛选，可以通过酶蛋白表达量进行筛选，可以通过报告基因进行筛选，还可以通过用于酶蛋白后期加工所用蛋白的表达丰度进行筛选。另外酵母双杂交或三杂交筛选法，转录调控因子筛选法，Riboswitch 筛选法以及表面展示技术也可以用来构建高通量筛选技术。感兴趣的可以阅读参考文献。

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传统的微生物快速筛选方法

 

琼脂平板筛选法

琼脂平板法可分为表型活性筛选和表型生长选择。表型活性筛选利用菌落周围产生的水解圈、颜色圈或荧光产物等进行酶活或目标产物筛选；表型生长选择根据细胞对抗生素或其他有害物质的抗性或营养缺陷型互补，在选择培养基中依据生长情况进行筛选。

琼脂平板筛选法基于透明圈、颜色圈的琼脂平板活性筛选或基于营养缺陷型或抗性的琼脂平板生长选择可作为简单易行的初筛方法，用于排除大量无活性和极低活性的突变体。但并不是所有的改造目标都能建立琼脂平板筛选法。琼脂平板筛选法，是一种简单直接的筛选方法，已用于多种水解酶 (如脂肪酶、酯酶、蛋白酶) 和氧化还原酶 (如漆酶) 等突变库的初步筛选中。
琼脂平板筛选法，对突变体间差异可视化较弱，仅适用于突变库的初步筛选，筛选后的突变体仍需要其他检测方法如微孔板法进行准确定量。数字影像分光光度计在琼脂平板筛选方法中的应用使琼脂平板法的灵敏度提高且通量达到 10^5克隆/d，若可根据目标酶或代谢产物的特性建立琼脂平板筛选方法，则无需使用依赖复杂仪器设备的超高通量筛选法。
平板筛选法是微生物在平板固体培养基上进行生殖反应，从而反应出来的性状。

微孔板筛选方法

微孔板筛选方法通过检测微孔板中底物或目标产物所引起的吸光度或荧光变化对其进行定量分析，可以保证筛选的精确性和灵敏度，是目前最常用的筛选方法。根据荧光或吸光度精确检测目标产物的微孔板 (Microtiter plate，MTP) 筛选方法应运而生，并已广泛应用于酶和细胞工厂的定向改造中。但微孔板筛选法存在通量低、操作耗时等缺点。
微孔板筛选法，可以理解成非常小的摇瓶，是微生物在液体环境中反应出来的性状。

为解决以上问题，近年来开发了荧光激活细胞分选 (FACS)和液滴微流控分选 (DMFS) 等超高通量筛选方法 ，用于酶和细胞工厂定向改造中大容量突变库的筛选。

 

 

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荧光激活细胞分选 (FACS)

FACS（Fluorescence-activated cell sorting） 是一种可对单细胞进行高效分选的荧光激活细胞分选技术。FACS方法首先必须建立酶活性表型与其编码基因的偶联，即将酶活性转化为可检测的荧光信号，并与酶所在的细胞构建物理联系，保持表型与基因型的一致性。
根据荧光产物与酶及其编码基因偶联形式的不同，现有的 FACS 酶活性筛选体系可分为细胞膜表面展示、胞内荧光产物的富集、荧光蛋白表达活性报告等类型。
例如在构建岩藻糖基转移酶的高通量筛选方法时，就通过“胞内荧光产物富集”的原理，构建了其FACS快速筛选方法。其基本原理是荧光底物可以自由穿透细胞膜，在酶的催化作用下转化成产物。该荧光产物由于与底物分子结构和大小存在差异不能被细胞膜所识别而富集在细胞内，使得细胞产生荧光，且荧光信号强度的大小与酶活性的高低成正比，所以可通过流式细胞仪进行单细胞超高通量筛选。该方法在唾液酸转移酶等酶制剂高通量筛选中应用。
FACS技术可以和诱变选育相结合使用，FACS可以识别分离活细胞，从而和微孔板结合提高筛选效果，例如李红月等在筛选高产吡咯喹啉醌菌株时，使用该技术。
当检测目标为胞外分泌酶或代谢产物时，可将细胞包埋在水/油/水双液滴或水凝胶中从而保证基因型和表型的关联。液滴包埋拓宽了 FACS 的应用范围。

FACS 可以根据细胞大小或荧光以高达 107 克隆/h 的速率对细胞进行分选。此外，FACS 可以直接将筛选到的优势突变体分配到微孔板中进行回收与鉴定。

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液滴微流控筛选 (DMFS)

DMFS 方法通过在芯片上持续高频 (>10 kHz)地将单个细胞包埋在液滴中实现基因型与表型的偶联，并通过检测液滴内的物质信号进行定量分析与分选，其筛选通量高达 105 克隆/h。
油包水液滴提供的纳升至皮升级反应区室，使此筛选方法不仅适用于细胞内酶或代谢产物的筛选，也适用于胞外分泌酶或代谢产物的筛选。此方法相比于常规的微升至毫升级反应体系缩小了百万倍以上，对试剂的需求量大大降低，在用到昂贵底物或试剂时具有明显优势。
此外，单层液滴包埋后仍可进行分析试剂的注入、液滴融合、分裂等，大大提高了操作的灵活性。
DMFS 结合了精密的液滴操作和快速分选系统，已经成为定向改造胞外酶和代谢物突变库筛选的有力工具。自 2010 年 Agresti 等首次利用液滴微流控成功地改造辣根过氧化物酶后，DMFS 已广泛地应用到其他酶和细胞工厂的定向改造中。

参考文献：

[1]杨建花, 苏晓岚,and 朱蕾蕾."高通量筛选系统在定向改造中的新进展." 生物工程学报 37.07(2021):2197-2210. doi:10.13345/j.cjb.200431.
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[3]李红月, 曾伟主,and 周景文."高产吡咯喹啉醌扭脱甲基杆菌的高通量选育." 生物工程学报 34.05(2018):794-802. doi:10.13345/j.cjb.170440.
[4]谭玉萌.基于单细胞超高通量筛选方法的α-1,3-岩藻糖基转移酶分子定向进化.2017.上海交通大学,MA thesis.
[5]唐双焱, 梁朝宁,and 蒋培霞."高通量筛选工具的设计与应用." 生物工程学报 28.07(2012):781-788. doi:10.13345/j.cjb.2012.07.001.